Toxikológia živočíchov

Obsah

Toxicita organických látok

ADI (Acceptable Daily Intake) - prípustný denný príjem, t.j. denná expozičná dávka, ktorá pravdepodobne nebude mať škodlivé účinky, ani keď expozícia bude pokračovať po celý život jedinca

Dávka (Dose) - množstvo toxickej substancie prijaté organizmom (človek, zviera) za jednotku času

Expozičné cesty (Exposure pathway) – definície procesov, ktorými sa daný faktor dostáva zo zdroja cez zložky životného prostredia do organizmu zahrňujúcej jeho transport aj expozičný vstup (inhalácia, požitie, vstrebávanie kožou a iné)

LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level) – najnižšia dávka (úroveň expozície), pri ktorej je ešte pozorovaný nepriaznivý účinok na štatisticky významnej úrovni v porovnaní s kontrolnou skupinou

Nebezpečná látka – látka vykazujúca jednu, alebo viac nebezpečných vlastností, napríklad výbušnosť, horľavosť, žieravosť, dráždivosť, toxicitu, karcinogenitu, mutagenitu, atď.

NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) – najvyššia dávka (úroveň expozície), pri ktorej ešte nie je pozorovaná žiadna nepriaznivá odpoveď na štatisticky významnej úrovni v porovnaní s kontrolnou skupinou. Určité účinky môžu byť pozorované, nie sú však považované za nežiadúce, ani za prekurzory nežiadúcich účinkov. Pre charakterizáciu rizika u rôznych NOAEL je do úvahy braná vždy najvyššia hodnota.

NOEC (No Observed Effect Concentration) – najvyššia koncentrácia bez štatisticky významných škodlivých ekotoxických účinkov

NOEL (No Observed Effect Level) – najvyššia možná úroveň expozície testovaných organizmov určitou špecifickou chemickou látkou (zlúčeninou), pri ktorej nie je pozorovaná žiadna štatisticky významná nepriaznivá odpoveď v porovnaní s kontrolnou skupinou.

TDI (Tolerable Daily Intake) - prípustný denný príjem, tj. denná expozičná dávka, ktorá pravdepodobne nebude mať škodlivé účinky, ani keď expozícia bude pokračovať po celý život jedinca

Toxicita (Toxicity) - schopnosť chemickej látky vyvolať poškodenie (intoxikáciu), je charakterizovaná smrtiacou dávkou

  • Testy akútnej toxicity
  • Testy chronickej toxicity
  • Špeciálne testy toxicity

TEST AKÚTNEJ TOXICITY

  • jednorazové perorálne (najčastejšie žiadané) alebo parentálne (kožná, intramuskulárna, intravenózna aplikácia) podanie zvyčajne vysokej toxickej a terapeutickej koncentrácie, pričom účinok sa prejaví počas 24 hodín
  • 2 druhy zvierat (hlodavec a nehlodavec)
  • klinický obraz: prejavy otravy a úmrtnosť, zmeny správania, letargia, spánok, kóma, príjem potravy zvierat, slinenie, hnačky, ako aj pitevný nález u uhynutých zvierat i tých, čo prežili, hodnotenie rozdielov v rámci pohlavia I druhu zvierat
  • Orálna
    • Klinické vyšetrenie: príznaky toxicity – zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchania a krvného obehu, vegetatívneho a centrálneho nervového systému, motorickej aktivity a správania, kŕče, slinenie, hnačky, letargia, spánok a kóma
    • Makroskopická pitva: u všetkých zvierat uhynutých aj utratených
    • Hodnotenie: hodnotí sa mortalita, klinické symptómy intoxikácie, prírastky hmotnosti a patomorfologické zmeny v priebehu 14-dňového experimentu
  • Inhalačná
    • stanovenie toxicity testovanej látky po krátkodobej inhalačnej expozícii
    • Testovací systém: potkan (Wistar) – obe pohlavia
    • Príprava testovanej látky: inhalovateľné formy – aerosol, para
    • Inhalačný box – prietok vzduchu, sledovanie koncentrácie v dýchacej zóne, meranie teploty a vlhkosti (min. 4 hod. expozície)
    • Hodnotenie: hodnotí sa mortalita, klinické symptómy intoxikácie, prírastky hmotnosti a patomorfologické zmeny v priebehu 14-dňového experimentu (horná a dolná časť dýchacieho traktu)
  • Dermálna
    • stanovenie toxicity testovanej látky po krátkodobej dermálnej expozícii
    • Testovací systém – potkan (Wistar) – obe pohlavia
    • Prevedenie: príprava zvierat – holenie, váženie, značenie
    • Aplikácia rovnomerne na plochu asi 10% celkového povrchu tela
    • Doba expozície: 24 hod. (fixovanie testovanej látky pomocou obväzu a nedráždivej náplaste – zabránenie orálnemu príjmu)
    • Po uplynutí expozície zbytky odstránené vodou
  • PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE
  • PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA
  • Letálna dávka LD50/LC50 – stredná letálna dávka - štatisticky vypočítaná dávka (alebo koncentrácia) látky (všeobecne vyjadrená na jednotku telesnej hmotnosti), pri ktorej sa očakáva zapríčinenie smrti polovice (50%) jedincov druhu, ktorí ju prijali
  • LT50 – stredný letálny čas

TEST CHRONICKEJ TOXICITY

  • cieľ: nájsť najvyššiu koncentráciu sledovanej látky, ktorá nevyvolá žiaden dokázateľný toxický účinok
  • podávanie: min. 3 mesiace, kratšie 7 – 28 dní
  • na myšiach a potkanoch (králiky, morčatá, škrečok, psi, primáti) – sledovanej látke vystavené počas celého svojho života
  • založené na identifikácii karcinogénnych a mutagénnych účinkov na niekoľkých generáciách
  • požiadavky na takéto štúdie sú opísané v „Code of Federal Regulations”
  • hodnotí sa: správanie zvierat, príjem potravy, skrátenie dĺžky života, možné kumulatívne účinky a potencionálne karcinogénne účinky na jednotlivé orgány, systémy, ovplyvnenie funkcií, hematologické a biochemické laboratórne vyšetrenie krvi (krvný obraz) a moču
  • po usmrtení zvierat sa vykonáva: dôkladná makroskopická I mikroskopická analýza tkanív a orgánov exponovaných zvierat (hmotnosť orgánov, morfologické a histologické zmeny)
  • TOXICITA PO 28-DŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE – ORÁLNA (žalúdočnou sondou)
  • INHALAČNÁ (expozícia 6 hodín)
  • DERMÁLNA (fixácia na cca 10% povrchu tela)
  • TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY: OPAKOVANÁ 90-DŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY U HLODAVCOV/TEST V OPAKOVANÝCH DÁVKACH
  • ŠTÚDIA SUBCHRONICKEJ DERMÁLNEJ TOXICITY PO 90-DŇOVEJ OPAKOVANEJ KOŽNEJ APLIKÁCII U HLODAVCOV
  • TEST TOXICITY SUBCHRONICKEJ INHALÁCIE 90-DŇOVÝ TEST OPAKOVANÉHO INHALAČNÉHO VYSTAVENIA NA HLODAVCOCH
  • CHRONICKÁ TOXICITA
  • KARCINIGENITA
  • KOMBINOVANÁ CHRONICKÁ TOXICITA/KARCINOGENITA
  • DVOJGENERAČNÁ ŠTÚDIA REPRODUKČNEJ TOXICITY (informácie o možných toxických účinkoch testovanej látky na reprodukčnú schopnosť samca/samice alebo na vývoj potomstva: funkcia pohlavných žliaz, priebeh estrálneho cyklu, chovanie pri párení, gravidity, pôrodu a laktácie, mortalita, rast a vývoj potomstva)

Laboratórne zvieratá

  • Laboratórna myš (Mus musculus var. alba)
    • hmotnosť - 30 – 40 g (všežravec)
    • pohlavná dospelosť – 6. týždeň
    • dĺžka gravidity – 17-21 dní
    • počet mláďat vo vrhu – cca 12
    • citlivá na výkyvy teploty
    • samčia rivalita
  • Laboratórny potkan (Rattus norvegicus var. alba)
    • hmotnosť - 250 – 400 g (všežravec)
    • pohlavná dospelosť – 12. týždeň
    • dĺžka gravidity – 19-22 dní
    • počet mláďat vo vrhu – cca 8 – 16
    • krotké, odolnejšie
    • malá biologická variabilita
  • Morča domáce (Cavia aperea)
    • hmotnosť - 700 – 750 g
    • dĺžka gravidity – 19-22 dní
    • počet mláďat vo vrhu – cca 1 – 6
  • Králik domáci (Oryctoloagus cuniculus)
    • hmotnosť – 3,5 – 5,5 kg
    • dĺžka gravidity – 29-30 dní
    • počet mláďat vo vrhu – cca 1 - 13
  • Pes domáci (Canis familiaris)
    • najčastejšie plemeno beagle (vľúdna povaha)
    • hmotnosť – 10 – 15 kg
    • dĺžka gravidity – 64 dní
  • Makak rhesus
    • kompletne známa DNA ako u 3. primáta
    • 20 + 1 pár pohlavných chromozómov
    • gény: 97,5% šimpanz,99% človek
    • gény HLA (Human Leukocyte Antigen)
    • génové rodiny PRAME
    • najviac využívaný v lekárskom výskume
    • Rh faktor, vakcína proti detskej obrne

Podmienky pre prácu s laboratórnymi zvieratami

  • rešpektovanie zákona na ochranu zvierat
  • zriadenie nezávislej odbornej komisie
  • osvedčenie odbornej spôsobilosti pre prácu s pokusnými zvieratami
  • etika práce na laboratórnych zvieratách
  • veterinárne osvedčenie
  • protokol o pokuse
  • zákaz používať túlavé a opustené zvieratá

IN VITRO testy

  • po zhodnotení akútnej a chronickej toxicity
  • na určenie potenciálnej mutagenity, karcinogenity, teratogenity, ovplyvnenia fertility, environmentálnej toxicity a klastogenity chemikálií (DNA poškodenie), aj testy na zistenie senzibilizácie a dráždivosti
  • Mutagénnosť (AMESove testy) - In vitro test chromozómovej odchýlky u cicavcov
    • in vivo test mikrojadra erytrocytu u cicavcov
    • bakteriálny test reverzných mutácií
    • in vitro test mutácií génov buniek cicavcov
  • Poleptanie kože in vitro: test pomocou transkutánneho elektrického odporu - ter
  • neplánovanej syntézy dna (unscheduled dna synthesis – uds) - ex vivo
  • mutagénnosť – in vitro test chromozómovej odchýlky u cicavcov
  • Chromozómové aberácie – zmeny v štruktúre alebo počtenchromozómov
  • Použitie kultúry cicavčích lymfocytov periférnej krvi – expozície buniek testovanou látkou – spracovanie kultúry, farbenie, vyhodnotenie pod mikroskopom
  • Hodnotenie 200 mitóz – hodnotí sa v metafáze – fáze bunkového cyklu, kedy sú chromozómy najlepšie viditeľné
  • Výsledok: percento aberentných buniek negatívnych voči kontrole

Bakteriálny test reverzných mutácií

  • Detekcia génových mutácií – mutácia v géne pre syntézu His (Trp) (esenciálne AMK)
  • Porovnanie počtu vyrastených kolónií po pôsobení testovanej látky s negatívnou kontrolou

In vivo test mikrojadra erytrocytu u cicavcov

Princíp testu:

  • expozícia kultúry cicavčích lymfocytov periférnej krvi testovanej látky
  • odstránenie testovanej látky
  • kultivácia exponovaných buniek spracovanej kultúry, farbenie a vyhodnotenie pod mikroskopom
  • detekcia mikrojadier, ktoré vznikajú poruchami delenia behom mitózy v nezrelých erytrocytoch

In vitro test mutácií génov buniek cicavcov

Princíp testu:

  • stanovenie génovej mutácie v cicavčej bunkovej línii
  • TK (thymidínkináza) deficientné bunky (mutácia TK+/- TK -/-) a selektívne médium (prostredie trifluorthymidínu
  • u kmeňov TK+/- toxické účinky, prežijú len mutantné bunky)
Postup:
  • K bunkám v suspenzii alebo jednovrstvovej kultúre sa pridá testovaná látka v rade koncentrácií
  • Hodnotí sa zvýšenie počtu mutácií vzhľadom k celkovému počtu buniek v kultúre (mutačná frekvencia)
  • Pozitívny výsledok: závislosť na dávke, trojnásobné zvýšenie počtu mutácií oproti negatívnej kontrole

Poleptanie kože in vitro

  • Model ľudskej kože
  • Princíp:
    • nanesenie testovanej látky na povrch trojrozmerného odelu ľudskej kože
    • omytie fosfátovým pufrom
    • kultivácia s MTT
    • zistenie účinku na životnosť buniek
    • výpočet relatívnej toxicity vzhľadom k negatívnej kontrole
  • Cytotoxicita: vyjadruje sa ako redukcia aktivity mitochondriálnej dehydrogenázy meraním aktivity tvorby formazánu z MTT – meria sa spektrofotometricky (v mitochondriách živých buniek je MTT redukovaná dehydrogenázou na modrý formazánový precipitát, ten je cez noc z buniek extrahovaný okyseleným izopropanolom a kvantifikovaný spektrofotometricky)
  • Výsledok: látka leptavá alebo neleptavá pre kožu

EPIDEMIOLOGICKÉ ŠTÚDIE A SAR

Epidemiologické štúdie

  • založené na pozorovaní veľkého počtu ľudí vystavených vplyvu škodlivín v životnom alebo pracovnom prostredí
  • zistené výsledky už nevyžadujú extrapoláciu ako je tomu pri štúdiách na zvieratách SAR (Structure Activity Relationship) –
  • SAR–analýzy sú založené na porovnávaní štrukturálnych, fyzikálnych a chemických vlastností
  • látky s jej neznámymi rizikami s podobnými chemikáliami, ktoré majú známe toxické účinky

HERBICÍDY

  • chemické prípravky určené na ničenie nežiaducich rastlín
  • nedodržanie technologických postupov riziko akútnych otráv zvierat, resp. vodných organizmov
  • Všeobecné účinky: zrýchlené dýchanie, hnačky, svalová slabosť, kŕče, hypertermia, smrť
  • Účinky na reprodukčný systém: rakovina prostaty, porušenie spermatogenézy – zníženie koncentrácie a pohyblivosti spermií, morfologické abnormality; rakovina prsníkov, vaječníkov, ovplyvnenie estrálneho cyklu, pokles počtu životaschopných mláďat, abnormality vo vývoji plodu

Rozdelenie podľa chemického zloženia:

  1. anorganické
  2. organické

Rozdelenie podľa ich účinku:

  1. selektívne (výberové) - pri vhodnom použití ničia niektoré buriny, pričom nepoškodia pestované rastliny
  2. neselektívne (totálne) - ničia všetky rastliny

Rozdelenie podľa spôsobu, akým na rastlinu účinkujú:

  1. dotykové (kontaktné) - ničia len zasiahnuté časti rastlín
  2. systémové (translokačné) - cievnymi zväzkami sa rozvádzajú do celého organizmu rastliny
  3. pôdne - pôsobia cez pôdu (predovšetkým koreňmi), spravidla pri klíčení a vchádzaní burín

  • deriváty fenolov a herbicídnych olejov - pôsobia kontaktne a ničia jednoročné buriny v porastoch mrkvovitých rastlín a obilninách
  • deriváty fenoxymastných kyselín - systémové herbicídy, ktoré ničia nadzemnú i podzemnú časť burín. V nízkych koncentráciách stimulujú rast rastlín a vo vyšších dávkach brzdia rast tým, že spôsobujú ťažké fyziologické poruchy a narúšajú látkovú premenu. Patria k nim prípravky napr. Na báze MCPA.
  • deriváty triazínu - koreňové systémové herbicídy, rušivo zasahujú do fotosyntézy, čím sa porušuje normálna asimilácia a tvorba zásobného škrobu. Zasiahnuté buriny majú žlté listy, ktoré na okrajoch zosychajú (Zeazin do kukurice).
  • deriváty močoviny - sú herbicídne účinné. Na ich účinok má veľký vplyv vlhkosť pôdy (napr. Arelan do obilnín)
  • karbamáty a tiokarbamáty - prijímajú hlavne klíčiace semená rastlín, porušujú delenie buniek (napr. Betanal do cukrovej repy)
  • chlorované mastné kyseliny - herbicídy tejto skupiny sa používajú na ničenie burinných tráv. Spôsobujú ťažké fyziologické poruchy rastlín, pôsobia translokačne.
  • deriváty kyseliny benzoovej - väčšina zlúčenín tejto skupiny sa používa ako listový herbicíd so systémovým účinkom. Niektoré sú pôdnymi herbicídmi.
  • substituované benzonitrily a amidy – účinné proti jednoklíčno- a dvojklíčnolistovým burinám
  • deriváty diazínov
  • kvartérne amóniové soli - pôsobia predovšetkým kontaktne i ako desikanty
  • ostatné organické herbicídy - patria sem rozličné herbicídne látky, ktoré nemožno zaradiť do žiadnej z predchádzajúcich skupín

DERIVÁTY FENOXYMASTNÝCH KYSELÍN